荧光光谱测量解决方案

荧光从广义上来说是指一种发光现象，分子发出的光。有几种类型的发光。

光致发光是光能或光子激发光子的发射。

化学发光，定义为化学能激发光子的发光，这包括生物发光，如在萤火虫和许多海洋生物中看到的。

电致发光，是当电能或强电场刺激光子的发射，例如在一些照明应用中。

具体来说，荧光是一种光致发光，光使电子处于激发态。激发态通过振动向环境迅速损失热能，然后从最低的单线态激发态发射出光子。这个光子发射过程与其他非辐射过程竞争，包括能量传递和热损失。

当使用“荧光”一词时，同样的测量方法通常适用于上述发光类别中的任何一种。

荧光粉末试剂

荧光测量是一种分析技术，利用物质在受到激发后发射出的荧光辐射的强度、衰减速率、寿命等特征，对物质进行分析和研究。荧光物质在特定波长的辐射能量辐射下，部分电子跃迁到高能级态，能发射出具有一定光谱分布的辐射，且一般都是在各个方向上辐射能量的散射光，并在短时间内通过非辐射跃迁或受激发射的方式，退回到低能级态，释放出能量，并以荧光的形式辐射出来，产生荧光信号。

荧光光谱测量产生的荧光能量比激发光的光子能量小，只相当于激发光能量的3%左右，其灵敏度高、选择性强、样品用量少、方法简便、具备环保性，可以反映物质的分子结构、电子能级结构等信息，荧光测量。荧光测量技术也因其高灵敏度、无创或微创等特点，适用于分析物质的结构、组成、含量、活性等方面，在材料（溶液、粉末、薄膜）科学、环境分析、生物分析、分子基因、细胞生物、医疗诊断和药物筛选等多个领域中有着广泛的应用。

常见荧光团在紫外和可见光谱上的荧光发射光谱

Fluorescence emission spectra of some common fluorophores across the UV and visible spectrum.

荧光染料吸收激发光的效率称为分子消光系数。分子消光系数越大，给定波长范围内光吸收的可能性就越大（诱发荧光发射的前提条件之一）。发射光的产率称为量子产率，即发射的量子数与吸收的量子数之比（许多商用荧光染料的产率在0.1和0.9之间）。量子产率低于1是能量通过非辐射路径（如热或者光化学反应），而不是通过荧光的再辐射路径损失能量的结果。下表中给出了一组特定荧光染料的荧光量子产率。请注意，有些荧光染料的量子产率似乎很低（苯），而其他则很高（荧光素和罗丹明-B）。

光源的分子消光系数、量子产率和平均发光强度（固有亮度）以及荧光寿命（激发态的持续时间）都是影响荧光发射强度和可用性的重要因素。此外，荧光染料周围的局部环境是决定荧光发射特性的关键因素。环境中的溶剂粘度、离子浓度、pH值和疏水性等变量，对荧光强度和激发态的寿命都有着重要影响。

基本测量原理

• 荧光测量

荧光测量的原理是基于分子的能级结构和分子的荧光现象。利用物质在受到光激发后，部分电子从基态跃迁到激发态，然后在短时间内通过非辐射跃迁或受激发射的方式，退回到基态。在这个过程中，物质释放出能量，并以荧光的形式辐射出来，产生荧光信号。荧光信号的特征包括荧光强度、荧光寿命、荧光发射光谱等。荧光强度是荧光信号的强度，与激发光强度成正比；荧光寿命是荧光信号的寿命，与物质的性质有关；荧光发射光谱是荧光信号的波长分布，可以反映物质的组成和结构。荧光测量可以通过测量荧光信号的强度、寿命、发射光谱等特征，来对物质进行分析和研究。

在荧光测量中，使用光谱仪对样品进行测量。荧光光谱仪可以通过调整激发波长和检测波长，以及对仪器进行校准，来获取样品的荧光光谱数据。

光谱仪内部构造图

Internal structure diagram of spectrometer

• 光致发光量子效率测量

荧光和磷光的吸收和发光过程能量图

能级图描述了普通有机分子的电子能级，并标示了能级间的电子跃迁。S₀、S₁和T₁分别代表基态，低单态和低三重态。光激发后，激发态分子可以沿几种跃迁路径，包括辐射过程和非辐射过程而回到基态。辐射过程涉及了光发射，例如荧光和磷光。非辐射过程涉及内转换和系统间热释放。辐射过程和非辐射过程相互竞争。

所谓光致发光（Photoluminescence简称PL），是指物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激发导致发光的现象。也指物质吸收光子（或电磁波）后重新辐射出光子（或电磁波）的过程。光致发光过程包括荧光发光和磷光发光。

从量子力学理论上，这一过程可以描述为物质吸收光子跃迁到较高能级的激发态后返回低能态，同时放出光子的过程。光致荧光发光是多种形式的荧光（Fluorescence）中的一种。原理图如下图：

荧光产生的过程

而在现阶段光致发光材料的研究中，对荧光量子效率的计算非常重要，因为这是反映光致发光材料发光能力的重要特征指标。

荧光量子效率又称荧光量子产额（quantum yield of fluorescence）或荧光效率。一般情况下，荧光量子效率、荧光量子产额与荧光效率描述等价。首先让激发光照射到空白容器，获得激发光谱，得总光子数。然后，在容器中放入样品，再用激发光照射获得未吸收光子数和发射光子数。通过单位时间（秒）内，发射光子（绿色区域）和吸收光子数（蓝色区域）的比值，计算出绝对荧光量子产率（PLQY）。可以使用下列公式表达：

测量样品的量子产率有两种方法：

1、相对量子产率测量：需要一种已知量子产率的标准品作为参照，通过对标准物和样品进行吸光度和荧光的测量换算得到样品的量子产率。只适用于液体样品。

2、绝对量子产率测量：不需要标准样品进行对比，广泛适用于液体、薄膜和粉末样品。在进行测量时需要积分球附件；积分球内表面涂层一般是高反射性材料，比如硫酸钡和聚四氟乙烯。样品表面各个方向的激发光或者是发射光进行积分球均匀化后从出射口出来，并进入到单色器中最后被检测器检测到。

测试绝对荧光量子产率方法

• 电致发光量子效率测量

电致发光（Electroluminescent，简称EL），是通过加在两电极的电压产生电场，被电场激发的电子碰击发光中心，而引致电子在能级间的跃迁、变化、复合导致发光的一种物理现象。由于电致发光产品具有发光效率高、器件寿命长、响应速度快、视角特性好、色彩度强、成本价格低、可弯曲等特点，在显示器和照明领域有非常广阔的应用前景。

决定电致发光产品性能是否优良的，就是电致发光器件了。我们常说到的OLED、QLED都属于这类器件。它们主要包括五层结构：阴极、电子传递层、发光层、空穴传递层和阳极。其中发光层的材料称为电致发光材料，OLED器件的发光层为有机分子材料，QLED器件的发光层为量子点材料。

电致发光器件结构示意

电致发光器件的EQE（外量子效率）值是决定器件封装以后光效的重要参数之一，也是真正决定电致发光器件是否能够商业化的重要参数之一。无论对于显示器还是照明，从电能转化为光能的发光效率都非常重要，其主要反映了输入功率的利用率。发光效率越高，器件的热损耗越小，能量利用率越高。在电致发光器件的研究中，对应的参数则为外量子效率（EQE，External Quantum Efficiency）。

现在普遍的EQE测量方法有两种，第一种是通过亮度计测量法线方向的亮度，通过标准朗伯体分布理论计算得到器件的EQE值。该方法有严重的缺点：实际中器件的朗伯体分布并非标准的余弦分布，会有部分分布不均的现象，此时通过理论计算的结果会非常不准确。

光分布法测试值（实心点）与朗伯体预测值（空心点）的区别

第二种EQE的测量方法是通过积分球配件，将器件的整体光通量收集，并通过计算得到器件的EQE。该方法又有两种测量方案，一种是将器件置于积分球球壁上，仅测量器件的前向通量，称为2π法；一种是将器件置于积分球内部，测量器件的整体通量，称为4π法。

积分球法EQE测试结果实例——四种颜色的OLED电致发光器

荧光测量方案

• 荧光测量

激发光谱和发射光谱是荧光光谱中的两种：

荧光激发光谱：荧光激发光谱是让不同波长的激发光源激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，所绘制的图表示荧光物质在不同波长激发光源的激发下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率，即为荧光激发光谱。荧光发射光谱的形状与激发光的波长无关 。

荧光发射光谱：荧光发射光谱则是使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，亦即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，光谱曲线表示为某一固定波长的激发光源激发作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。

发射光谱是固定激发波的波长，测定发射光强度与波长（有时候也测波数或者频率等）的关系，通俗而不太严谨地说，发射光谱测定的是发射光的颜色。激发光谱是固定发射光的波长，测量激发光的波长与荧光强度之间的关系。如从发射光谱知道某分子最大发射波长是500nm，我们希望知道用哪个波长的激发光照射这个分子，可以获得最大的发射强度，就可以通过测定激发光谱来实现。一般情况下，最大激发波长小于最大发射波长。实际应用中，根据我个人经验，发射光谱用的比激发光谱要多。

荧光光谱测量首先需要明确测量样品的类型和要求。其次，需要确定荧光光谱测量的条件和参数，如激发波长、检测波长、积分时间等。最后，需要制定荧光光谱测量的标准操作流程和数据分析方法：

样品类型和要求：需要明确样品的物理化学性质、浓度、形态等，以及测量的目的和要求，如定量分析、质量分析、结构分析等。

1. 荧光光谱测量条件和参数：需要选择合适的荧光光谱仪，确定激发波长、检测波长、积分时间、激发光强度等参数。目前大多数荧光测量是相对测量，测量过程受设备激发光源、荧光自身的非均匀性光漂白和检测设备的检测限等因素的影响，导致测量数据不准确，限制了仪器之间、实验室之间测量结果的可比性。仪器测量数据的准确性受以下6个因素影响，分别为：

   （1）光照尺寸大小；

   （2）照射到样品的激发光强度；

   （3）光照射到样品的均匀性；

   （4）仪器自身的分辨力；

   （5）检测器光谱响应；

   （6）光谱分辨力。

在荧光痕量检测中，光源的稳定性是影响荧光测量的重要因素，关系着整个检测系统的稳定及精度。将校准玻片放置在荧光显微镜下，测量荧光校准玻片的荧光强度，如果荧光强度发生了偏差，可以根据偏差及时校准荧光显微镜，不仅可以实现对荧光显微镜稳定性校准； 同时还可以评估不同荧光仪器性能，实现不同仪器测量数据的可比性，提高荧光显微镜测量的准确性。

1. 对于复杂样品，可能需要进行预处理，如分离、纯化、稀释等。荧光物质筛选及其光谱特性合适的荧光染料主要有 3 个标准：

   （1）荧光物质的激发波长和发射波长与所校准荧光检测设备通道相匹配；

   （2）所选荧光物质的激发光谱与发射光谱具有较大的斯托克斯位移；

   （3）荧光物质具有良好的稳定性，即较小的光漂白。常用的荧光校准材料主要是有机荧光染料，如Cy3、Cy5、罗丹明等，由于有机染料在相对较短的时间内即可被光漂白，光稳定性较差。量子点具有很好的光稳定性，具有较大的斯托克斯位移，同时具有宽激发谱和窄发射谱，基于这些良好性能，我们选择了量子点作为候选荧光染料。

2. 标准操作流程和数据分析方法：需要制定荧光光谱测量的标准操作流程，包括样品制备、仪器操作、数据采集、数据处理等步骤。同时，需要选择合适的数据处理方法，如基线校正、峰形分析、曲线拟合等，以及质量控制方法，如标准曲线法、内标法等。

• 光致发光量子效率测量

在开发新的发光材料过程中，提高它们的光致发光效率是至关重要的，提高发光材料的量子效率就需要精确量子效率测量技术，iSpecRad-PQY光致发光量子效率测量系统操作便捷，是莱森光学（LiSen Optics）专门针对器件的光致发光特性进行有效测量，可在手套箱内完成搭建，无需将样品取出即可完成光致发光量子效率的测试。

光致发光量子效率测量系统

系统搭配包括光谱仪，带辐射校准光源积分球，激光光源、光纤及配套治具等，莱森光学光道仪信噪比高，杂散光低，动态范用大适合不同波段和强度的激发光和发射光测量，同时，该系统配有强大的专用测试软件，操作逻辑简单，测试过程快捷方便。莱森光学iSpecRad-PQY光致发光量子效率系统可以支持粉末、薄膜和液体样品的测量，适用于有机金属复合物、荧光探针、绕料敏化型PV材料，OLED材料、LED荧光粉等领域。

荧光（液体）测量实验实景

• 电致量子效率测量

iSpecRad-EQE电致发光量子效率测量系统是莱森光学（LiSen Optics）综合发光特性测量平台中的重要成员，可专门针对发光器件的光电特性进行有效测量。系统搭配包括光谱仪、带辐射校准光源积分球、电流源表、探针台、光纤及治具等。光谱仪具有信噪比高、杂散光低，动态范围大等特性，适合不同波段和强度的激发光和发射光测量，可确保测量结果的准确性。同时，系统配有强大的专用测试软件，操作逻辑简单，测试过程迅速。

电致发光量子效率测量系统

iSpecRad-EQE电致发光量子效率测量系统能够以高检测精度对电致发光器件进行纵深测量，得到全面的电致发光效率参数（外量子效率等）以及相关的电学、辐射度学、光度学、色度学等参数；同时该系统集成了稳定性测试模块，可以对器件的老化过程进行测试，且同时得到器件老化过程的全面信息，即涵盖了上述发光效率、电学、辐射度学、光度学、色度学等全面参数（通常的老化测试仪，仅对电流、电压和相对亮度进行测试）。在生物荧光标记、太阳能电池、光催化、化学分析、食品检测及活体成像等领域具有巨大的潜在应用价值。

• 总结

荧光光谱测量、光致发光量子效率测量和电致发光量子效率测量都是半导体材料光电性能测量方法，但它们的激发方式和测量原理不同，因此在实际应用中有不同的优缺点和适用范围。

荧光光谱测量是通过测量物质在受到激发后发射出的荧光辐射的光谱，来对物质进行分析和研究。荧光光谱测量适用于分析物质的分子结构和电子能级结构等方面，具有非接触、快速、无损、可重复性好等优点。但荧光光谱测量对样品要求较高，需要样品能够发射荧光辐射，因此并不适用于所有物质。

 不同体积的硫酸奎宁溶液的荧光量子效率

光致发光量子效率测量是通过短脉冲激光对半导体材料进行光激发，测量电荷载流子的发射率和捕获率，从而计算出半导体材料的量子效率。光致量子效率测量适用于半导体材料的表面和体材料的量子效率测量，具有非接触、快速、无损、可重复性好等优点。但光致量子效率测量对样品要求较高，需要样品具有良好的电学性能和光学性能，且激光参数需要精确控制。

电致发光量子效率测量是通过在外加电场的作用下，测量半导体材料的量子效率。电致量子效率测量适用于器件的量子效率测量，可以测量器件的内部量子效率，具有高分辨率、高灵敏度等优点，但需要制备器件，操作较为复杂，且需要施加电场，可能会影响到材料的性质。

综上所述，荧光光谱测量、光致量子效率测量和电致量子效率测量各有优缺点和适用范围，需要根据具体的研究对象和目的来选择合适的方法。

应用领域

荧光光谱是一种重要的分析方法，其应用领域非常广泛。以下是荧光光谱在不同领域中的具体应用：

1. 生物分析：荧光光谱可以用于分析生物分子，如蛋白质、核酸等。荧光光谱分析可以用于生物分子的定量和质量分析，以及蛋白质和核酸的荧光标记和探针。在医学领域，荧光光谱在生物分析方面的应用非常广泛，如用于检测血液中的蛋白质和其他生物分子，以及肿瘤标记物等。

浓度为 1μm 的牛血清白蛋白（BSA）溶液中的色氨酸的荧光光谱随温度变化的情况

温度从 5°C 逐渐增加到 70°C，荧光光谱的强度 下降，荧光峰位置向着短波长方向蓝移。各向异性或时间 分辨的各向异性荧光光谱也可以用来获得有关蛋白的尺 寸、形状和重新取向运动的信息。

1. 医学诊断：荧光光谱在医学诊断方面也有广泛的应用。荧光光谱可以用于检测生物标记物和药物，以便诊断疾病和监测治疗进展。例如，荧光光谱技术被广泛应用于心血管疾病、肿瘤、传染病等方面的诊断。

负载Fura-2的心房细胞的细胞内钙反应

1. 环境监测：荧光光谱可以用于环境监测，如检测水中的重金属、有机污染物等。荧光光谱技术对于水质监测、空气质量检测等方面的应用也非常广泛。

三种不同油污的光谱

1. 材料科学：荧光光谱可以用于材料表征，如荧光探针、荧光染料等。荧光光谱技术可以用于材料的表征和分析，例如，用于分析半导体材料和涂料中的成分和结构变化等。

荧光素染料的吸收/激发（蓝色）和荧光（红色）光谱

典型荧光染料的吸收-发射光谱图

1. 食品安全：荧光光谱技术可以用于食品中有害物质的检测，如农药、重金属等。荧光光谱技术对于食品质量和安全方面的监测也有很多的应用。

不同硫胺素浓度和汞结合形成硫胺素的反应速率

除了以上的应用领域，荧光测量还可以用于研究物质的动力学过程，例如药物分子的扩散、蛋白质的折叠等；还可以用于研究物质的微观结构，例如膜蛋白的结构、DNA的构象等。因此，荧光测量在化学、生物、物理等多个领域都有广泛的应用。

光致发光量子效率测量

• 无机光致发光、有机光致发光

• EL器件封装前体

• 有机金属复合物、络化物化合物的测量

• 染料敏化型PV材料、OLED材料

• LED、有机EL用荧光体的量子效率测量

• 膜状样品的透过荧光/反射荧光的量子效率测量（非接触式荧光粉用荧光体样品等）

• 量子Dot、荧光探头（探针）、生体领域、包接化合物等的荧光测量

• 色素敏化型太阳电池的量子效率测量

电致量子效率测量

• 无机/有机电致发光

• 分子薄膜EL器件

• AIE（聚集诱导发光）材料

• 量子点发光二极管（QLED）、有机发光二极管（OLED）、发光二极管（LED）、钙钛矿发光二极管（PeLED）等其他各种类型的电致发光器件

配置推荐：

• LiSpec-HS系列高灵敏度光谱仪 / LiSpec-HSR系列热电制冷高性能光谱仪

LiSpec-HS400系列高灵敏度光谱仪是一款成功地把紫外可见近红外高量子效率和高测量速度相结合的高灵敏度光谱仪，其独有的消杂散光技术、降噪电路控制技术、再加上出众的高量子效率探测器性能，使光谱仪的灵敏度、信噪比得到极大的提升。

LiSpec-HSR系列热电制冷高性能光谱仪是采用了高量子效率的薄型背照制冷型面阵CCD具有非常高的科研级灵敏度，同时采用了高性能稳定的TE制冷装置、独有降噪低噪声电路控制技术，光谱仪暗噪声极低，优良的稳定性，高信噪比。

• 光纤（荧光反射探头）

采用纯度很高的进口石英纤芯，光纤类型采用多模光纤，数值孔径为0.22，也可以为用户提供如NA=0.12、0.15/0.26/0.37等数值孔径的多模光纤

• 荧光比色皿支架

LS-CUV-FL带有两个成90°角的准直透镜，适合荧光测量，另外两个端口装有镀铝膜的SiO₂反射镜（LS-CUV-EL-FL-MIRROR）。LS-CUV-FL-ALL有4个准直透镜，构成两个垂直光路。

• iSpecRad-PQY荧光量子效率积分球

通用的荧光量子效率积分球有三个开口，分别是光入射口，样品口和光出射口。光入射口置有准直镜，将激发光源准直照射到样品，光出射口内置有挡板，防止入射光直接出射。常用的样品口配套有荧光比色皿支架，可用于液体、粉末、固体等样品测量。